Клинико-генетические аспекты формирования «патологического спортивного сердца» у высококвалифицированных спортсменов

Введение

В последнее десятилетие самое пристальное внимание мировой спортивно-медицинской науки было обращено на выявление факторов риска внезапной сердечной смерти у спортсменов (ВСС). Известно, что высококвалифицированные спортсмены имеют выраженные структурно-функциональные изменения сердца, которые связаны с видом спорта, полом, и, возможно, генетическими факторами [4-6,15]. Степень физиологических изменений «спортивного сердца» может быть столь существенной, что ее приходится дифференцировать с патологическими структурными изменениями при кардиомиопатиях [9,12,16-18]. К сожалению, печальные факты зарубежной статистики подтверждают недостаточную изученность вопросов «нормы» и «патологии» в спорте [16-18]. В ряде известных популяционных исследований наглядно показано, что смертность от сердечно-сосудистых заболеваний среди спортсменов от 12 до 35 лет в 2,5 раза превышает данный показатель для лиц, не занимающихся спортом [18]. К числу наиболее частых причин ВСС большинство зарубежных авторов относят гипертрофическую кардиомиопатию (60%), аномалии строения коронарных артерий (25%) и миокардиты (10%) [18].

В настоящее время для изучения границ индивидуальной адаптации к физическим нагрузкам используются современные молекулярно-генетические технологии. Уже найдено более 130 наследственных детерминант успешности в проявлении целого ряда физических качеств, комбинации которых дают возможность индивидуализировать физические нагрузки в большинстве видов спорта [8]. С другой стороны, отмечена ассоциация некоторых из «спортивных» генетических полиморфизмов (АСЕ, PPARA, PPARD и NFATC4) с рядом заболеваний, таких, как гипертоническая и ишемическая болезнь сердца, аритмии, сахарный диабет 2-го типа и ожирение [1, 2, 7, 15]. Возможно, специфические комбинации этих генетических факторов не только влияют на рост спортивных показателей, но и под воздействием спортивных перегрузок способствуют патологической трансформации спортивного сердца.

Таким образом, целью нашего многоэтапного исследования было изучение влияния наследственных факторов, связанных с физической активностью (полиморфизмов генов АСЕ, PPARA, PPARD и NFATC4) на морфофункциональные характеристики сердечнососудистой системы высококвалифицированных спортсменов.

Экспериментальная часть

В исследовании приняли участие 68 спортсменов (37 мужчин и 31 женщина) в возрасте от 20 до 25 лет, специализирующихся в академической гребле (n = 48) и конькобежном многоборье (n = 20). Все спортсмены являлись членами или ближайшим резервом олимпийских сборных команд России по академической гребле и конькобежному многоборью и имели высокие спортивные разряды: МС (n=56), МСМК (n=7), ЗМС (n=5). Контрольная группа для сравнения результатов генетического тестирования состояла из 1073 человек (без стажа занятий спортом), жителей Санкт-Петербурга, Москвы и Набережных Челнов (женщины 18±0,1 лет, n = 585; мужчины 18,6±1,1 лет, n = 488).

Электрокардиографическое (ЭКГ) исследование в покое проводилось с использованием цифрового электрокардиографа «Альтон» (Россия) по общепринятой методике, включающей анализ 12 стандартных отведений. Эхокардиографическая (Эхо-кг) оценка морфофункциональных характеристик миокарда спортсменов проводилась на ультразвуковом сканере Aloka-3500 фазированным датчиком с частотой импульсации 3,5 МГц. Миокард, клапаны и подклапанные структуры изучали в M- и B-режимах. Основные измерения проводились в М-режиме на изображении длинной оси левого желудочка (ЛЖ), полученном при стандартном парастернальном положении датчика. Определяли толщину межжелудочковой перегородки в диастолу, толщину задней стенки ЛЖ в диастолу, конечно-диастолический размер ЛЖ, конечно-систолический размер ЛЖ, конечно-диастолический объем ЛЖ, конечно-систолический объем ЛЖ, массу миокарда ЛЖ (ММЛЖ, г) и индекс ММЛЖ (ИММЛЖ, г/м2).

Определение максимального потребления кислорода у гребцов в тесте с нарастающей нагрузкой производили на механическом гребном эргометре PM 3 (Concept II, США). Определение максимального потребления кислорода (МПК, л/мин либо мл/мин/кг) у конькобежцев в тесте с нарастающей нагрузкой производили на велоэргометре. Во время теста постоянно регистрировали показатели газообмена и частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин) (газоанализатор MetaMax 3B, Cortex, Германия). Содержание лактата определяли электрохимическим методом (Super GL easy, Dr. Mueller, Германия); капиллярную кровь (20 мкл) брали из пальца после каждой ступени и сразу же после окончания работы (La , ммоль/л).

Выделение ДНК: для молекулярно-генетического анализа использовали образцы ДНК испытуемых, выделенных сорбентным методом либо методом щелочной экстракции в зависимости от способа забора биологического материала [1].

Генотипирование: Полиморфизмы генов ACE, NFATC4, PPARA и PPARD определяли с помощью полимеразной цепной реакции и последующего рестриктного анализа по методикам, описанным ранее [1, 2, 4, 7].

Статистическая обработка данных была выполнена с применением компьютерной программы «GraphPad InStat». Определяли: средние значения (M), стандартную ошибку (±SEM) и среднее квадратическое отклонение (s). Значимость различий в частоте аллелей между сравниваемыми выборками определяли с использованием критерия хи-квадрат. Сравнение групп по количественному признаку (эхокардиографические и физиологические показатели) проводили с помощью непарного теста. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

В статье использовали следующие сокращения: IVSD (см) - толщина межжелудочковой перегородки в диастолу; LVIDd (см) - внутренний диаметр левого желудочка (ЛЖ) в диастолу; LVPWd (см) - толщина задней стенки ЛЖ; LVIDs (см) - внутренний диаметр ЛЖ в систолу; VO2/^ - отношение максимального потребления кислорода к весу спортсмена.

Результаты и их обсуждение

Нормальные ЭКГ имели 48% обследуемых спортсменов; незначительные изменения в виде миграций суправентрикулярного водителя ритма (СВВР) предсердного ритма и единичных предсердных экстрасистол выявлены у 42%. ЭКГ-признаки гипертрофии левого желудочка имели 5 (7%) спортсменов, синдром Вольфа - Паркинсона - Уайта (WPW) был выявлен у 3 (3%) обследуемых. При эхокардиографическом обследовании 17 (25%) спортсменов (5 мужчин и 12 женщин) имели толщину ЗСЛЖ и МЖП до 12,0 мм и КДД от 45 до 55,0 мм, что принято расценивать как вариант «физиологического спортивного сердца»; 51 (75%) спортсмен (31 мужчина и 20 женщин) имели гипертрофию ЗСЛЖ и МЖП от 12 до 17 мм и КДД от 41 до 58 мм.

Основное внимание в нашем исследовании уделялось изучению функциональных характеристик физиологического и патологического спортивного сердца. Как было сказано выше, главной особенностью спортивного сердца является наличие физиологической гипертрофии миокарда, которая, по мнению ведущих спортивных кардиологов, не должна превышать 12 мм [16-18]. Другой не менее важной характеристикой физиологического спортивного сердца является незначительное увеличение КДД левого желудочка (до 55 мм), но не превышающее критического значения, равного 60 мм. В нашем исследовании физиологическое (до 12 мм) увеличение толщины ЗСЛЖ было обнаружено лишь у 25% спортсменов. 75% имели увеличение ЗСЛЖ от 12 до 17 мм. Ни у одного из обследуемых спортсменов мы не обнаружили увеличение КДД, превышающее критический уровень, равный 60 мм. При сравнении результатов электро- и эхо-кардиографических исследований мы обратили внимание на то, что при электрокардиографическом анализе признаки гипертрофии правого и левого желудочка были выявлены лишь у 5 спортсменов, что вступает в противоречие с результатами эхокардиографического обследования, подтвердившего наличие значительного (более 12,0 мм) увеличения толщины ЗСЛЖ и МЖП у 51 спортсмена. Такое несоответствие можно объяснить тем, что, согласно большинству исследований, формирование физиологического «спортивного сердца» сопровождается гипертрофией как левых, так и правых его отделов. Симметричность гипертрофических изменений, как правило, приводит к отсутствию на ЭКГ клинически значимых изменений и формированию практически нормальной ЭКГ [17, 19]. Наличие электрокардиографических признаков гипертрофии миокарда у спортсменов при отсутствии у них эхокардиографически подтвержденной асимметричной гипертрофии может свидетельствовать о доморфологическом вовлечении в процесс либо правого, либо левого отделов сердца и являться предиктором формирования патологического спортивного сердца у спортсменов [17, 18]. В нашем случае подгруппа с электрокардиографическими признаками гипертрофии миокарда состояла исключительно из мужчин, имеющих высокий спортивный разряд (3 - МСМК и 2 - ЗМС) и входящих в состав сборных России по гребле (4) и конькобежному спорту (1).

Таким образом, в процессе функционального обследования нами были выявлены 5 групп спортсменов: 2 подгруппы (мужчины и женщины) с ЗСЛЖ до 12 мм, 2 подгруппы (мужчины и женщины) с гипертрофией ЗСЛЖ более 12 мм и 1 подгруппа (мужчины) с ЭКГ-признаками гипертрофии ЗСЛЖ. Характеристика вышеназванных подгрупп и результаты их клинического обследования представлены в табл. 1 и 2.

Характеристика подгрупп сравнения по виду спорта, квалификации, возрасту и данным антропометрии

Подгруппы сравнения	n	Вид спорта	Квалификация	Возраст	Рост, см	Вес , кг
Спортсменки с ЗСЛЖ более 12 мм	20	4 коньки + 16 гребля	2 КМС+16МС + 2 МСМК	20,8 ± 2,0	177,2 ± 2,3	71,7 ± 1,0
Спортсменки с ЗСЛЖ менее 12 мм	12	5 коньки + 7 гребля	2 КМС + 10 МС	18,8 ± 2,2	175,2 ± 1,5	69,2 ± 2,2
Спортсмены с ЗСЛЖ более 12 мм	31	10 коньки + 21 гребля	5 ЗМС +5 МСМК + 20 МС +1 КМС	21,8 ± 0,8	189,5 ± 1,2	86,6 ± 1,1
Спортсмены с ЗСЛЖ менее 12 мм	5	2 коньки + 3 гребля	5 МС	9,8 ± 2,1	185,2 ± 2,5	85,3 ± 2,1
Спортсмены с инверсией Т (II, III, avf, V4-6)	5	1 коньки + 4 гребля	1МСМК+ 4 ЗМС	22,3 ± 0,2	185,8 ± 2,3	85,7 ± 1,5

Результаты эхокардиографического и эргоспирометрического обследования спортсменов 5 подгрупп

Подгруппы сравнения	IVSD, см	LVIDd, см	LVPWd, см	LVIDs, см	У()2/кг, мл/мин
Спортсменки с ЗСЛЖ более 12 мм	1,13±0,01	4,56±0,02	1,32±0,03	2,98±0,01	45,8±3,2
Спортсменки с ЗСЛЖ менее 12 мм	1,07±0,04	4,71±0,01	1,01±0,01	3,04±0,02	48,2±2,2
Спортсмены с ЗСЛЖ более 12 мм	1,41±0,03	5,02±0,03	1,44±0,02	3,42±0,01	59,5±2,3
Спортсмены с ЗСЛЖ менее 12 мм	1,24±0,01	4,84±0,01	1,10±0,01	3,20±0,02	57,4±2,4
Спортсмены с инверсией Т (II, III, avf, V4-6)	1,40±0,02	5,03±0,01	1,43±0,03	3,30±0,03	60±3,2

Анализ результатов генетического исследования выявил у высококвалифицированных спортсменов значимые различия в распределении двух из четырех исследуемых полиморфизмов: I/D полиморфизма гена АСЕ и Gly160Ala полиморфизма гена NFATC4. Как у женщин, так и у мужчин частота аллеля I (ACE) была выше в подгруппе с гипертрофией миокарда левого желудочка более 12 мм. Анализ распределения Gly160Ala полиморфизма гена NFATC4 выявил значимо более высокую частоту аллеля Ala у мужчин в подгруппе с гипертрофией по сравнению как с подгруппой без гипертрофии миокарда, так и с контролем (табл. 3 и 4).
 

Сравнение распределения частот аллелей генов ACE, PPARA, PPARD и NFATC4 у женщин с гипертрофией миокарда более 12 мм, без нее и в контрольной группе

	ACE	%	PPARA	%	PPARD	%	NFATC4	%
Спортсменки с ЗСЛЖ > 12 мм	I	72,5*	G	87,5	T	82,5	G	45
	D	27,5*	C	12,5	C	17,5	A	55
Спортсменки с ЗСЛЖ < 12 мм	I	37,5 *	G	83,3	T	79,2	G	45,8
	D	62,5*	C	16,7	C	20,8	A	54,2
Контроль	I	48,5	G	83,2	T	89,7	G	43,6
	D	51,5	C	16,8	C	10,3	A	56,4

*P < 0,05 (различия между подгруппами и контролем).

Сравнение распределения частот аллелей генов ACE, PPARA, PPARD и NFATC4 у мужчин с гипертрофией миокарда более 12 мм, с признаками асимметричной гипертрофии на ЭКГ, без нее и в контрольной группе

Подгруппы	Частоты аллелей генов, %
	ACE	%	PPARA	%	PPARD	%	NFATC4	%
Спортсмены с ЗСЛЖ > 12 мм	I	59,6*	G	88,5	T	92,3	G	34,6*
	D	40,4*	C	11,5	C	7,7	A	65,4*
Спортсмены с ЗСЛЖ < 12 мм	I	30*	G	90	T	90	G	40*
	D	70*	C	10	C	10	A	60*
Контроль	I	48,5	G	83,2	T	89,7	G	43,6
	D	51,5	C	16,8	C	10,3	A	56,4

Эта ситуация подтверждает мнение ряда авторов об особой роли вышеназванных генов в ремоделировании миокарда под влиянием функционального стресса [4-6,11,14,15]. Известно, что гипертрофия миокарда характеризуется существенным изменением генетической экспрессии в кардиомиоцитах [14]. Как показывают исследования, функциональный стресс потенцирует экспрессию многих генетических программ, среди которых наиболее важное значение имеют гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и гены сигнального пути кальциневрина. Существует мнение, что в генезе как физиологического, так и патологического ремоделирования миокарда у спортсменов важную роль играет перестройка гормональной регуляции по типу стресс-реакции с повышением активности ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [10]. Развивающийся при этом гемодинамический стресс, вызванный гиперактивацией РААС, способствует пролиферации соединительнотканных элементов миокарда (коллагена I типа) с последующим снижением его эластичности, приводящим к неэффективной гипертрофии и патологической дилатации «спортивного сердца» со снижением его функциональной активности. В исследовании нами получена достоверная корреляция (г = 0,62) I аллеля гена АСЕ с конечно-диастолическим диаметром полости левого желудочка, что подтверждает данные о возможном влиянии гена АСЕ на процессы ремоделирования миокарда, в том числе и у спортсменов. С другой стороны, выявленные нами более высокое процентное содержание Ala аллеля гена NFATC4 у спортсменов с гипертрофией миокарда ЗСЛЖ более 12 мм, а также статистически достоверная его корреляция (г = 0,65) с толщиной ЗСЛЖ позволяет предположить участие Ala (NFATC4) в развитии гипертрофии миокарда левого желудочка у спортсменов. Наши результаты согласуются с мнением современных исследователей о том, что специфическая активация кальциневрина и его нисходящего эффектора NFATC4 является достаточным фактором для индукции развития гипертрофического ответа у млекопитающих [2, 14]. К генам-мишеням транскрипционных факторов семейства NFAT относят гены интерлейкинов-1, -4, -5 (IL1, IL4, IL5; иммунный ответ), фактор некроза опухоли альфа (TNF; иммунный ответ), ген натрийуретических факторов (ANF, BNF; гипертрофический ответ миокарда), ген инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1; рост и регенерация скелетных мышц) и другие [2]. Как показано в исследованиях Molkentin с соавт. [13], в ответ на действие факторов роста кардиомиоциты увеличивают уровень цитоплазматического Ca2+, активирующего кальциневрин кальмодулинзависимую протеиновую фосфатазу - кальциневрин. Он, в свою очередь, активирует цитоплазматический фактор NFATC4, который путем его транслокации в ядро приводит к активации транскрипции различных структурных и регуляторных генов, в том числе и генов цитоки-нов ФНО-а и IL-1, 4, 5. Выявленная ранее взаимосвязь гена NFATC4 с физической активностью [2], а также полученная в исследовании значимо более высокая частота Ala аллеля NFATC4 у высококвалифицированных спортсменов с гипертрофией миокарда более 12 мм и значимая корреляция этого аллеля с толщиной ЗСЛЖ и инверсией Т подтверждают данное предположение.

Особое внимание в нашей работе было уделено анализу причин появления выраженных ЭКГ-изменений у 5 высококвалифицированных спортсменов с подтвержденной симметричной гипертрофией миокарда. В процессе интерпретации результатов исследования мы учитывали мнение ведущих зарубежных кардиологов, считающих, что физиологическими изменениями у спортсменов является только умеренная симметричная гипертрофия как правого, так и левого отделов сердца [18]. Наличие электрокардиографических признаков гипертрофии миокарда у спортсменов при отсутствии у них эхокардиографически подтвержденной асимметричной гипертрофии свидетельствует о доморфологическом вовлечении в процесс либо правого, либо левого отделов сердца и может являться предиктором формирования патологического спортивного сердца [16-18]. Сравнение антропометрических показателей и структурно-функциональных характеристик сердечно-сосудистой системы этих спортсменов с аналогичными данными спортсменов с гипертрофией миокарда, но без ЭКГ-изменений значимых различий между подгруппами не выявило (т.е группы по этим показателям значимо не различались). Однако при анализе распределения генотипов была выявлена значимо более высокая частота NFATC4 Ala аллеля в этой подгруппе (табл. 5).
 

Сравнение распределения частот аллелей генов ACE, PPARA, PPARD и NFATC4 у мужчин с инверсией зубца Т на ЭКГ (n = 5) и без нее (n = 26)

Подгруппы	Частоты аллелей генов, %
	ACE	%	PPARA	%	PPARD	%	NFATC4	%
Группа без инверсии зубца Т	I	59,6	G	88,5	T	92,3	G	34,6
	D	40,4**	C	11,5	C	7,7	A	65,4*
Группа с инверсией зубца Т	I	66,7**	G	91,6	T	100	G	25*
	D	33,3**	C	8,4	C	0	A	75*
Контроль	I	48,5	G	83,2	T	89,7	G	43,6
	D	51,5	C	16,8	C	10,3	A	56,4

Учитывая влияние NFATС4 на величину гипертрофического ответа у лабораторных животных [13], а также полученные ранее данные об участии продукта экспрессии данного гена (ФНО-а) в развитии имму-норегуляторной дисфункции у юных спортсменов со сниженными функциональными возможностями кис-лородтранспортной системы [3], можно предположить, что носительство NFATC4 Ala аллеля является неблагоприятным фактором для спортсменов, так как возможная его активация под действием спортивных перегрузок и гипоксического стресса экспрессирует факторы, участвующие в процессе патологического стрессиндуцированного ремоделирования миокарда у спортсменов.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Получены значимые различия в распределении аллелей генов ACE (I/D полиморфизм) и NFATC4 (Gly160Ala полиморфизм) в подгруппах спортсменов с гипертрофией миокарда и без нее. В подгруппах с гипертрофией миокарда были выявлены значимо более высокие частоты ACE I и NFATC4 Ala аллелей.
2. Получены статистически значимые корреляции ACE I аллеля с конечно-диастолическим диаметром полости левого желудочка у спортсменов (г = 0,62) и NFATC4 Ala аллеля с толщиной задней стенки левого желудочка в диастоле (г = 0,65), что подтверждает участие этих генов в ремоделировании «спортивного сердца».
3. Более высокие частоты ACE I и NFATC4 Ala аллелей были выявлены у спортсменов с гипертрофией миокарда ЗСЛЖ более 12 мм и инверсией зубца Т, что свидетельствует о возможном участии данных аллелей в стрессиндуцированном изменении электрогенеза сердечной мышцы под влиянием спортивных перегрузок.

Литература

1. Ахметов И.И., Астратенкова И.В., Рогозкин В.А. Ассоциация полиморфизма гена PPARD с физической деятельностью человека // Молекулярная биология. -2007. - Т. 41. - № 5. - С. 852-857.
2. Ахметов И.И., Попов Д.В., Шихова Ю.В. и др. Полиморфизм гена NFATC4 и аэробная выносливость у спортсменов // Технологии живых систем. - 2009. -№ 2.
3. Линде Е.В. Провоспалительные цитокины и особенности максимальных тредмил-тестов у юных спортсменов, тренирующих выносливость: Дис. ... канд. мед. наук. - М., 2004. - 17 с.
4. Линде Е.В., Астратенкова И.В., Ахметов И.И., Простова А.Б. Морфофункциональное ремоделиро-вание миокарда спортсменов и генетический полиморфизм // Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок: Сб. научных трудов. - 2006. -Вып. 2. - С. 23-38.
5. Линде Е.В., Ахметов И.И., Астратенкова И.В. и др. «Спортивное сердце» и генетический полиморфизм // Физкультура в профилактике, лечении и реабилитации - 2006. - № 4 (19). - С. 18-25.
6. Линде Е.В., Ахметов И.И., Астратенкова И.В., Федотова А.Г. Роль наследственных факторов в гипертрофии миокарда левого желудочка у высококвалифицированных спортсменов // Международный журнал интервенционной кардиоангиологии. - 2007. -№ 13. - С. 49-54.
7. Ahmetov I.I., Mozhayskaya I.A., Flavell D.M. et al. PPARa gene variation and physical performance in Russian athletes // Eur. J. Appl. Physiol. - 2006. - V. 97 (1). -P. 103-108.
8. Ahmetov I.I., Rogozkin VA. Genes, athlete status and training - An overview. In: Genetics and Sports, edited by Collins M. Basel. - Karger, 2009.
9. Futterman L.G., Myerburg R. Sudden death in athletes: an update // Sports Med. - 1998. - 26 (5). -P. 335.
10. Heine H. Grundheit - Krankcheit. Stress // Biol. Med. - 1997. - V. 26 (5). - P. 503-511.
11. Jamshidi Y., Montgomery H.E., Hense H.-W. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor a gene regulates left ventricular growth in response to exercise and hypertension // Circulation. - 2002. - V.105. - P. 950-955.
12. Maron B.J, Bonow R.O., Salberg L. et al. The first patient clinically diagnosed with hypertrophic cardio-myopathy // Am. J. Cardiol. - 2008. - V. 102 (10). -P. 1418-1420.
13. Molkentin J.D., Lu J.R., Antos C.L. et al. A calci-neurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy // Cell. - 1998. - V. 93. - P. 215-228.
14. Molkentin J.D. Calcineurin and beyond: cardiac hy-pertrophic signaling // Circ. Res. - 2000. - V. 87. -P. 731-738.
15. Montgomery H., Clarkson P., Dollery C.M. et al. Association of angiotensin-converting enzyme gene I/D polymorphism with change in left ventricular mass in response to physical training // Circulation. - 1997. -V. 96. - P. 741-747.
16. Pelliccia A., Maron B. et al. Remodeling of left ventricular hypertrophy in elite athletes after long-term deconditioning // Circulation. - 2005. - V. 105. - P. 944949.
17. Pellicia A., Maron B. Athletes heart electrocardiogram mimicking hypertrophic cardiomyopathy // Curr. Cardiol. Rep. - 2001. - V. 3 (2). - S. 147-151.
18. Priori S.G., Aliot E., Blomstrom-Lindqvist L. et al. Task force on sudden cardiac death of the European Society of Cardiology // Eur. Heart J. - 2001. - V. 22. - P. 13741450.
19. Sharp N.C., Koutedakis Y. Sport and the overtraining syndrome: Immunological aspect // Br. Med. Bull. -1992. - V. 48 (3). - P. 518-533.
20. Wei S., Chow L.T., Shum I.O. et al. Left and right ventricular collagen type I/III ratios and remodeling post-myocardial infarction // J. Card. Fail. - 1999. - V. 5. -P. 117-126.
21. Zaichuk T.A., Shroff E.H., Emmanuel R. et al. Nuclear factor of activated T cells balances angiogene-sis activation and inhibition // J. Exp. Med. - 2004. -V. 199. - P. 1513-1522.